Využití kapilární elektroforézy pro studium enzymů
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2010 |
| Druh | Vyžádané přednášky |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Popis | Enzymy, společně s ribozymy, tj. katalyticky aktivními molekulami RNA, jsou biokatalyzátory, které jsou nezbytné pro normální funkci každé prokaryontní i eukaryontní buňky. Jejich vysoká katalytická účinnost a specifita je rovněž předurčuje pro praktické uplatnění v biotechnologických procesech a v celé řadě analytických systémů. Stanovení enzymů tak představuje jednu z nejpoužívanějších procedur nejenom v biochemii a molekulární biologii, ale také v medicíně pro účely klinické diagnostiky, či ve farmacii při vývoji nových léčiv, u kterých je nutné znát jejich metabolismu či vzájemné interakce. Stanovení enzymů je také důležité při studiu jejich funkce a vlastností jako jsou substrátová specifita či reakční kinetika. Bohužel přímé stanovení jejich koncentrace není možné, neboť jsou v buňce přítomny v komplexní směsi s ostatními proteiny, například v již tak jednoduché buňce jako je bakterie Escherichia coli se vyskytuje 3000 proteinů, v lidské buňce je tento počet odhadován na více než 20 000. Jejich stanovení je však možné provádět nepřímo na základě jimi katalyzované reakce, tj. sledovat nárůst produktu reakce či úbytek jejího substrátu. K tomuto účelu je používána celá řada metod – fotometrických, elektrochemických, radiometrických a separačních včetně kapilární elektroforézy (CE). Ta zde přitom přináší celou řadu výhod, jako jsou rychlost analýzy, vysoká separační účinnost a malé množství vzorku. Stanovení aktivity enzymů pomocí CE lze provádět dvěma hlavními způsoby. Při klasickém stanovení probíhá enzymová reakce v reakční nádobce a CE je využita pouze pro separaci substrátu(ů) a produktu(ů) enzymové reakce. Druhou možností je metoda elektroforeticky zprostředkované mikroanalýzy – Electrophoretically Mediated Microanalysis (EMMA), kde kapilára slouží nejenom jako separační médium, ale také jako reakční prostředí pro enzymovou reakci. V přednášce bude na příkladech několika enzymových reakcí dokumentováno uplatnění obou těchto přístupů, hlavní pozornost pak bude věnována metodě EMMA, která kromě klasických výhod CE přináší také možnost plné automatizace příslušného stanovení. |
| Související projekty: |