Izolace RNA pro účely RT-PCR, Real-Time PCR a DNA čipů z tkání fixovaných ve formalínu a archivovaných v parafinových bločcích
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2004 |
| Druh | Článek ve sborníku |
| Konference | Edukační sborník - XXVIII. Brněnských onkologických dnů a XVIII. Konference pro sestry a laboranty. 26.-28. května 2004 |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Obor | Onkologie a hematologie |
| Klíčová slova | Izolace RNA; Real-Time PCR; formalin fixed tissue; lymphoma |
| Popis | Úvod Tkáně fixované ve formalínu a archivované v parafinových bločcích, jsou nejdostupnějším materiálem pro retrospektivní klinické studie. Význam tohoto zdroje narůstá v souvislosti s potřebou validace nově determinovaných diagnostických a prognostických markerů, jejichž výpovědní hodnotou je míra genové exprese. Kvantitativní analýza genové exprese je v současnosti nejčastěji prováděna pomocí Quantitative Real-Time PCR (QRT-PCR) a DNA čipů. Tyto metody vyžadují dostatečné množství kvalitní RNA, což v případě jednoho DNA čipu znamená 10-50 ěg celkové RNA. Problém izolace RNA z tkání archivovaných v parafinu spočívá zejména v její nepoužitelnosti pro vysoký stupeň degradace. K ní dochází především v mezidobí od získání tkáně do završení její fixace. Pro tento účel nevhodná formalínová fixace způsobuje navíc tvorbu tzv. "cross-linking" vazeb mezi nukleovými kyselinami a proteiny a kovalentně modifikuje RNA. Náročnost izolace kvalitní RNA z parafinových bločků za účelem kvantitativního hodnocení genové exprese dokresluje i to, že dosud byla ve světové literatuře publikována pouze jediná práce popisující takový postup. Výsledky V naší práci prezentujeme vlastní způsob izolace RNA, který jsme úspěšně vyzkoušeli u 40 vzorků tkání fixovaných ve formalinu a archivovaných v parafinových bločcích. Stáří bločků se pohybovalo v rozmezí 1 až 29 let, RNA získaná z cca 8 řezů o šířce 8 ěm dosahovala po nezbytném ošetření DNasou I průměrné koncentrace 330 ng/ěl a indexu absorbance A260/280 1,68+/-0,16. Elektroforéza prokázala ve všech případech určitý stupeň degradace RNA, nicméně byla vždy zachována zřetelná detekce 28S i 18S rRNA. Vyizolovaná RNA byla velmi úspěšně použita k RT-PCR a QRT-PCR. Výsledky QRT-PCR kvantifikující expresi sledovaného genu byly ve shodě s výsledky semikvantitativního imunohistochemického hodnocení korespondujícího proteinu (t-test: p = 0,003). Před izolací RNA jsme ustoupili od deparafinizace, která neovlivnila výtěžnost, nicméně snižovala kvalitu RNA. Lyzační roztok byl založen na Proteinase K, obsahoval inhibitory RNAsy a doba lyzace činila 12 hodin při teplotě 60C. K samotné izolaci jsme použili v modifikovaném postupu Trizol. Závěr Vlastním protokolem jsme provedli úspěšnou izolaci RNA z tkání fixovaných formalínem a archivovaných v parafinových bločcích. RNA dosahovala dostatečného množství a kvality k použití pro RT-PCR a QRT-PCR. Zda ji bude možné využít i pro DNA čipy testujeme v současnosti. |