Výhody a úskalí produkce proteinů v expresním systému kvasinky Pichia pastoris
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2006 |
| Druh | Konferenční abstrakty |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Popis | Během posledních desetiletí byla vyvinuta celá řada technik pro manipulaci s DNA týkajících se její identifikace, specifického štěpení a klonování genů do celé rady organismů, které jsou po genetické stránce velmi odlišné od původního organismu. Hlavním úkolem takto vzniklých organismů je často snadná a finančně ne-příliš nákladná produkce proteinu. U celé řady proteinů byla za „továrnu“ pro výrobu proteinů zvolená bakterie E. coli a to především díky jejímu rychlému růstu, snadnému klonování cílových genů a rychlé izolaci vzniklého proteinu. Na druhé straně je však E. coli prokaryotní organismus, který postrádá intracelulární organely jako je endoplazmatické retikulum nebo Golgiho aparát zodpovědné v eukaryotních organismech za modifikaci a správnou konformaci vzniklého proteinu. I přes tyto nevýhody může být mnoho eukaryotních proteinů produkováno v bakterii E. coli, avšak rovněž celá řada produkovaných proteinů je nefunkčních a těžko exprimovatelných v solubilní formě. Právě tyto důvody vedly k vyvíjení eukaryotních produkčních systému, mezi něž patří kvasinka Pichia pastoris. Pichia pastoris je methanoltrofní kvasinka upravená pro produkci rekombinantních proteinů, které jsou klonovány za velmi silný promotor methanol-indukované alkohol oxidázy (AOX1) vložený do expresních vektorů. Syntéza proteinu je tedy spouštěna přidáním methanolu do média, které neobsahuje zdroj uhlíku a tvoří tak jediný zdroj uhlíku pro kvasinku. Této skutečnosti se dá dále využít pro produkci proteinů 100% značených uhlíkem 13C, jejichž struktura se dá poté určit pomocí techniky NMR (Nukleárně Magnetická Rezonance). Syntetizované proteiny mohou být dále sekretovány do média, což umožňuje využití technik fermentace a velmi snadnou purifikaci vzniklého proteinu. V neposlední řadě je výhodou i možnost produkce celé řady proteinů, které jsou toxické pro bakteriální buňku a nemohou být tedy exprimovány v bakterii E. coli. Naše zkušenosti s produkcí proteinů pomocí kvasinky Pichia pastoris jsou demonstrovány na syntéze mutantních forem proteinu cryptogeinu pocházejícího z houby Phytophtora cryptogea a je ukázána možnost snadné purifikace pomocí kombinace iontové výměnné kapalinové chromatografie a vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi. |
| Související projekty: |