Pacient-specifické kardiomyocyty s variantou Y4734C-RYR2: Ca2+ přechody v kontrole a po aplikaci kofeinu
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2024 |
| Druh | Konferenční abstrakty |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Popis | Úvod: Různé formy srdečních arytmií jsou spojovány s variantami v genech kódujících strukturu srdečních iontových kanálů. Varianty v lidském ryanodinovém receptoru typu 2 (RYR2) jsou obvykle asociovány s katecholaminergní polymorfní komorovou tachykardií (CPVT). RYR2 je umístěn v membráně sarkoplazmatického retikula (SR) a řídí uvolňování Ca2+ do cytosolického prostoru, což je klíčové pro vazbu excitace s kontrakcí. V naší studii byla varianta p. Y4734C v RYR2 překvapivě nalezena u pacienta s idiopatickou fibrilací komor (IFK), a tedy bez specifických příznaků CPVT, přestože u jeho sestry nesoucí stejnou variantu byla CPVT diagnostikována. Jelikož varianta Y4734C-RYR2 nebyla doposud funkčně popsána, není jasné, zda může být příčinou vzniku IFK. Cílem této práce byla pilotní analýza vlivu varianty Y4734C-RYR2 na spontánní i kofeinem-indukované Ca2+ přechody u pacient-specifických kardiomyocytů odvozených z lidských indukovaných pluripotentních buněk (hiPSC-CM) v porovnání s hiPSC-CM nepříbuzné zdravé osoby. Metodika: Měření Ca2+ přechodů bylo prováděno na hiPSC-CM nesoucích variantu Y4734C-RYR2 (Y4734C, n = 11) a na zdravých nepříbuzných kontrolních kardiomyocytech (WT, n = 6) pomocí systému Myocyte Calcium and Contractility System (IonOptix). Bezprostředně před měřením byly buněčné shluky hiPSC-CM inkubovány při 37 °C po dobu 15 min v Tyrodově roztoku, který obsahoval ratiometrické fluorescenční Ca2+-senzitivní barvivo (Fura-2-AM, 1 µM). Následně byly opakovaně promyty a poté byly po dobu 10 minut inkubovány při 37 °C v Tyrodově roztoku. V průběhu měření nebyly buňky stimulovány. Měření byla prováděna v Tyrodově roztoku při 37 °C s krátkou aplikací roztoku 10 mM kofeinu na konci měření. Analýza Ca2+ přechodů byla provedena pomocí softwaru IonWizard. Ke statistickému zpracování dat byl využit software GraphPad Prism 7.05. Soubor dat byl testován na odlehlé hodnoty pomocí ROUT testu (Q = 1 %) a následně byl proveden Shapiro-Wilkův test s cílem zjistit, zda data vykazují normální rozložení. V případě normálního rozložení byl použit párový t-test, v opačném případě Wilcoxonův test, případně jejich nepárové varianty (Y4734C vs. WT). Výsledky: Bylo vyhodnoceno několik parametrů popisujících základní charakteristiky Ca2+ přechodu, konkrétně jeho amplituda, čas do dosažení jeho vrcholu a časová konstanta jeho poklesu, a to jednak v Tyrodově roztoku s cílem posoudit charakter spontánních Ca2+ přechodů u Y4734C a WT a pak při aplikaci 10 mM kofeinu, který umožňuje stanovit celkový obsah Ca2+ v SR. V žádném z těchto parametrů nebyly pozorovány signifikantní rozdíly mezi Y4734C a WT, a to ani v Tyrodově roztoku, ani v kofeinu. Po aplikaci kofeinu došlo u Y4734C a WT k signifikantnímu prodloužení času do dosažení vrcholu Ca2+ přechodu a časové konstanty jeho poklesu. U amplitudy Ca2+ přechodu překvapivě nedošlo k očekávanému nárůstu, amplituda byla paradoxně spíše snížena, a to dokonce signifikantně v případě Y4734C. Přestože v porovnání s dospělými kardiomyocyty jsou snížení či absence změny amplitudy Ca2+ přechodu po aplikaci kofeinu překvapivé, u hiPSC-CM jsou podobné nálezy poměrně obvyklé a pravděpodobně svědčí o nezralosti těchto buněk. Závěr: Dosavadní pokusy neprokázaly žádné signifikantní rozdíly v charakteru spontánních Ca2+ přechodů, ani v Ca2+ náplni SR u Y4734C a WT hiPSC-CM. Paradoxní pokles amplitudy Ca2+ přechodu indukovaného při aplikaci kofeinu bude dále analyzován s cílem vysvětlit jeho podstatu. |
| Související projekty: |