OPTIMALIZÁCIA IN VITRO DIFERENCIÁCIE A AKTIVÁCIE MONOCYTOV PRED ANALÝZOU EXPRESIE GÉNU PLAUR
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2022 |
| Druh | Konferenční abstrakty |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Popis | Cieľom práce bola optimalizácia procesu izolácie, diferenciácie a aktivácie monocytov. Snahou bolo dosiahnuť maximálne výťažky monocytov z odberu periférnej krvi, ich vysokú čistotu a najnižšiu možnú primárnu aktiváciu buniek. Výberom vhodnej koncentrácie cytokínov a inkubačnej doby sme sa snažili docieliť in-vitro diferenciáciu monocytov do makrofágov typu M1. V aktivovaných a plne diferencovaných monocytoch u pacientov s hereditárnym angioedémom, astmou a reumatoídnou artritídou bude následne sledovaná expresia génu PLAUR. Gén PLAUR kóduje proteín uPAR (CD87) ovplyvňujúci fibrinolýzu po jeho interakcii s urokinázovým aktivátorom plasminogénu (uPA), zrážanlivosť krvi a produkciu bradikinínu väzbou na FXII, ktorý sa aktivuje na povrchu buniek a moduluje bunečnú adhezivitu a migráciu cez interakcie s proteínmi extracelulárneho matrix. Z odberu periférnej krvi boli monocyty izolované metódou magnetickej separácie. Získané monocyty boli diferencované kombináciou cytokínov M-CSF a INF?, ktoré podporili diferenciáciu do M1 makrofágov. Čistota izolovaných monocytov, ich diferenciácia a aktivácia bola stanovená mikroskopicky a pomocou prietokovej cytometrie. Vyššie výťažky monocytov boli dosiahnuté použitím dvojnásobne koncentrovaného roztoku PBS pričom sa priemerný výťažok monocytov pohyboval okolo 150 000 buniek z 1 ml periférnej krvi s čistotou nad 95 %. Nízka aktivácia monocytov bola docielená pri použití sklenených skúmaviek a udržaním nízkej teploty (< 8 oC) bunečnej suspenzie počas celého procesu izolácie. Mikroskopickým pozorovaním bola stanovená najvhodnejšia dĺžka inkubácie monocytov a koncentrácie cytokínov MCSF a INFg, Diferenciácia a aktivácia monocytov bola stanovená meraniami na prietokovom cytometri na základe zvýšenej povrchovej expresie markerov CD86, CD38 a CCR7. Takto diferencované a aktivované monocyty sa ukázali byť vhodné pre ďalšie spracovanie. Výsledkom prevedených pokusov je optimalizovaný a verifikovaný postup izolácie a aktivácie monocytov potrebný na presnú analýzu expresie génu PLAUR. |
| Související projekty: |